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報告請於下星期四11/17中午12點前交給淑嫻
以下為課本內容
遇到細菌名字記得要改成斜體~
祝大家星期一期中考(?)順利!!!
實驗3 染色的方法(Staining Methods)
細菌非常微小而且透明無色，無法用一般的肉眼觀察。為了要研究其性質和鑑別診斷
，細菌必須經過染色才能在顯微鏡底下觀察。同時染色方法和鏡檢也成為研究細菌的一重
要工具。依照目的不同，可將細菌染色的方法分成下列四種：
1. 簡單染色法(Simple stain)：染色過程只使用單一試劑，可觀察細菌的型態、大小及
排列等。
2. 鑑別染色法(Differential stain)：使用多種試劑的染色，因細菌對試劑反應不同
，可將細菌做分類，如革蘭氏染色法(Gram stain)、耐酸性染色法(acid-fast stain)等。
3. 特別染色法(Special stain)：利用染色方法突顯出細菌的特別結構，如：鞭毛染色
(flagella stain)、莢膜染色(capsule stain)、孢子染色(spore stain)、核染色
(nuclear stain)等。
4. 負染色法(Negative stain)：使用酸性染劑(acidic dye)，如：India ink，negrosin
，不染細菌只染背景(background)。常用於不易染色的細菌，如：螺旋菌(Spirilla)等。
3-1簡單染色法(Simple Stain)
一、 目的
練習無菌操作、抹片的製作和進行單一染劑的染色，以觀察細菌的外形
(morphological shapes)和排列(arrangement)。
二、 原理
簡單染色法只以一種染劑對細菌的抹片做染色。所用的染劑通常是甲基藍
(methyl blue)、亞甲藍(methylene blue)、結晶紫(crystal violet)和石碳酸複紅
(carbolfuchsin)等帶有正電荷(positive charge)的鹼性染劑(basic dye)，而細菌
核酸(nucleic acid)和很多細胞壁的成分都帶有負電荷(negative charge)，因此染
劑主要是利用正負電荷互相吸引而使染劑顏色染上細菌。
三、 實驗材料
1. 細菌的培養：以nutrient agar plate(或broth)培養Escherichia coli，
Staphylococcus aureus等24小時內的新鮮培養菌(young culture)。
2. 試劑：methyl blue或methylene blue，香杉油(Cedarwood oil)、二甲苯(xylene)。
3. 儀器：酒精燈、接種還(loop)、顯微鏡(microscope)、玻片(glass slide)。
四、 實驗步驟
1. 玻片的準備：做細菌抹片的玻片必須乾淨，首先要除去玻片上的油脂。處理的方法，
可用肥皂和清水擦洗或將玻片直接在火燄上過火2~3次。
2. 抹片的製備：避免製作出太厚和太密的抹片是做好抹片的首要條件。一個好的抹片必
須是乾燥後，形成一白霧狀的均勻薄層。抹片製作時，細菌是培養在液態培養基
(liquid medium)或固態培養基(solid medium)中，有不同的操作方法。
(1) 液態培養基：以無菌操作方法，用接種環挑取懸浮菌液至玻片抹開，成為約1公分圓環。
(2) 固態培養基：先挑一滴無菌水在玻片的中央，再用接種環從固態培養基挑取一點點的
菌，在含有一滴水的位置，由中央往外輕而均勻的抹開。
3. 加熱固定：除非將抹片固定，否則在染色的過程中，細菌將會被沖洗掉。加熱固定的
方法為將玻片直接快速在火燄上過火2~3分鐘等待液體蒸發即可(切勿火烤過久，以免破壞
菌體原本結構)。
4. 置1~2滴染劑於抹片處，靜置適當時間，約1~3分鐘。
5. 開啟水龍頭的自來水沖洗掉抹片上多餘的染劑(由玻片上緣輕輕沖洗至無色即可)。
6. 乾燥(室溫下自行風乾或在火燄上過火乾燥)。
7. 鏡檢，在抹片處滴上香杉油，再利用物鏡100x的油鏡(oil immersion)觀察。
8. 觀察完畢，請用二甲苯將100x物鏡擦拭乾淨。
3-2革蘭氏染色法(Gram Stain)
一、 目的
利用革蘭氏鑑別染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
二、 原理
革蘭氏染色的原理，需要四種試劑加至抹片上，第一種試劑以結晶紫
(crystal violet)做初染(primary stain)，初染的功能是使所有細菌染上顏色。第二種
試劑使用媒染劑(mordant)，利用革蘭氏碘溶液(Gram's iodine solution)與結晶紫作用
形成不可溶複合物(complex)，以加強染劑染色的能力。第三種試劑是以95%酒精
(95% alcohol)做為脫色劑(decolorizing agent)，因細胞壁結構和成分組成不同，使得
有些初染劑可被脫掉，有些則不可以被脫掉。第四種試劑以番紅(safranin)做為對照染
劑(counter stain)，和初染劑呈對比的顏色，當脫色後，若對照染劑不被細菌所吸收，
則仍維持初染劑的顏色，若對照染劑會被細菌所吸收，則呈現對照染劑的顏色。以此方
法可將細菌作分類。
三、 實驗材料
1. 細菌的培養：以nutrient agar plate(或broth)培養Escherichia coli，
Staphylococcus aureus等24小時內的新鮮培養菌。
2. 試劑：crystal violet，Gram's iodine，95% alcohol和safranin O
(或carbolfuchsin)，Cedarwood oil，xylene。
3. 儀器：酒精燈、接種還、顯微鏡、玻片。
四、 實驗步驟
1. 準備乾淨的玻片(玻片處理如實驗3-1)。
2. 使用滅菌的接種環，製備含有Escherichia coli或Staphylococcus aureus的抹片。
3. 讓抹片乾燥，以一般加熱固定法固定。
4. 置1~2滴crystal violet於抹片處，靜置1分鐘。
5. 以自來水沖洗(由玻片上緣輕輕沖洗至無色)。
6. 滴1~2滴Gram's iodine溶液於抹片處，靜置1分鐘。
7. 以自來水沖洗(由玻片上緣輕輕沖洗至無色)。
8. 以95%酒精或丙酮退色。注意：脫色劑要一滴一滴的加，直至洗出液不再呈現
crystal violet顏色即刻停止，否則過度脫色會獲得相反的染色結果。
9. 用水龍頭的自來水沖洗(由玻片上緣輕輕沖洗至無色)。
10. 以safranin O做對照染色，靜置30~45秒。
11. 用水龍頭的自來水沖洗。
12. 乾燥。
13. 鏡檢，利用物鏡100x的油鏡觀察。
實驗報告
3-1簡單染色法
結果紀錄
1. 畫出顯微鏡下所看到的情形。
2. 敘述所看到的型態(球狀、桿狀、螺旋狀)和排列方式。
菌種: Escherichia coli Staphylococcus aureus
形態:
排列: 沒有觀察
顏色:
3-2革蘭氏染色
結果紀錄
1. 畫出顯微鏡下所看到的情形。
2. 敘述所觀察到的型態和排列方式。
3. 敘述細菌經染色後的顏色。
4. 區別各染色細菌是屬於革蘭氏陽性或陰性。
菌種: Escherichia coli Staphylococcus aureus
形態:
排列:
顏色:
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