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atp冷光儀應用 在 ATP生物冷光反應技術應用在生乳生菌數之快速檢測 的推薦與評價
https://www.csas.org.tw/fullcsas/1999283/11.htm
摘要：將生乳的生菌數以傳統平板計數與ATP生物冷光反應對同一乳樣所測得之相對吸光
值（relative light unit, RLU），求出兩者對數值間的線性關係。利用此一迴歸方程式
的標準曲線，可對生乳生菌數進行快速估算，全程費時6分鐘。所得之迴歸方程式y＝
1.29x＋2.06（n＝62），其相關係數為0.87（P＜0.05），顯示傳統平板計數生菌數與ATP
生物冷光反應之RLU值有良好的相關性。此結果顯示可應用ATP生物冷光反應技術快速估算
生乳之生菌數，並可用此技術取代傳統的美藍試驗檢測生乳菌數，讓乳品製造業者能快速
地了解原料的品質，以利後段加工的進行。（關鍵語：生乳、ATP生物冷光反應、美藍還
原試驗）
───────────────────────────────────────
(1)食品工業發展研究所。
(2)Corresponding author.
緒 言
ATP生物冷光反應技術（ATP bioluminescence technique）是一種快速檢測方法
，用以檢測ATP的含量。此法為美國太空總署於1960年代發展出來的技術（Griffiths,
1996），其反應原理與螢火虫體發光反應相同，在螢光素（luciferin）與螢光素繍（
luciferase）存在下，使ATP與螢光素及螢光素繍作用產生螢光（Kricka, 1988）。其反
應方程式如下所示：
美國太空總署當初發展此項技術的目的，是希望能用以檢測外太空是否有生命物
質存在，然近來生物冷光反應卻在食品與醫藥領域中被使用。ATP廣泛存在於地球上的各
類生物體中，除了微生物體內，食品中亦有多量的ATP。以細菌而言，一個菌體內ATP含量
約為10-18M；真菌類菌體因體積較大，一個細胞則含10-15～10-16M。目前ATP生物冷光儀
檢測ATP含量的極限約是10-12M，換言之，欲檢測細菌類的微生物，菌數需超過103
CFU/ml，機器才能檢出（山本，1997）。
應用此種技術檢測食品中生菌數時，需先將食品中非微生物的ATP水解（
Griffiths, 1993），再將微生物體內的ATP釋放出來，與酵素反應，最後以ATP生物冷光
儀檢測。倘若欲檢測食品接觸表面的清潔度，則無需去除食品中的ATP，直接測量即可。
檢測結果則以相對吸光值（relative light unit, RLU）的多寡來表示ATP濃度的高低，
藉此反推微生物含量和可能的食物殘留，以表示食物接觸面清潔度的情況。
目前ATP生物冷光反應技術已廣泛地應用在各項食品產業，包括生乳生菌數估算
（Giese, 1997）、設備清潔度的評估（任等，1998；Seeger and Griffiths, 1994）及
成品架售期的推估（Phillips and Griffiths, 1985），畜產業中屠體的污染評估（
Siragusa et al., 1995），果汁產業的菌數估算（Graumlich, 1985）、製酒工業及飲料
業等（王等，1998；Tydrich, 1996）。
鮮乳的營養價值很高，是人體鈣質等各類營養素最佳的來源，也因為乳品的高營
養價值，不適當的集乳或貯藏條件常造成生乳的生菌數過高，因而影響鮮乳的風味與品質
。業者雖了解生乳生菌數會影響成品的品質，然一般傳統微生物檢測法需耗時兩天，當得
知生乳品質時，乳品早已加工至成品階段，甚至被消費者飲用完畢；目前，雖有部份工廠
使用快速檢測方法測定生乳生菌數之方法，但大部份乳品工廠所使用的美藍還原試驗（
methylene blue reduction test）需費時八小時，無法配合生產時效需求；其準確性亦
常受光線、含氧量與操作技術等因子的影響（李等，1988），造成生乳計價時的困擾。
本實驗是以ATP生物冷光反應技術應用於生乳生菌數的快速檢測，期望能以ATP生
物冷光儀所測得的RLU值，利用化學檢測取代微生物檢測，快速地估算出生乳的生菌數，
並配合美藍還原試驗，比較生乳生菌數、RLU值與美藍還原試驗結果，用以評估ATP生物冷
光反應在生乳生菌數檢測之適用性。
材料與方法
一. 試樣的製備
依據農委會於86年11月生乳計價會議所得之草案資料，在生乳生菌數部份，生乳
計價的菌數分級是每毫升乳樣在10萬至120萬個生菌數間，分成七組。本實驗生乳乳樣由
台灣北部與中部酪農戶取得，乳樣生菌數多分布在104～105 CFU/ml左右，若以本實驗所
取得之乳樣進行試驗，其生菌數均接近在105 CFU/ml上下，無法得到充分的數據供應迴歸
方程式的運算。經考慮生乳品質低下的原因，除集乳設備與環境污染外，多為貯藏溫度與
時間不當所造成。為設計出適合本研究不同範圍的生乳生菌數含量，有的乳樣直接檢測，
有的乳樣經過12～24小時，在較高溫（8～16℃）的暴露，預期找到生乳生菌數ATP含量範
圍相對應之生菌數可至120萬/ml以上，再進行生乳乳樣檢測（包括生乳生菌數檢測、生物
冷光反應RLU檢測及美藍還原試驗）。
二. 生乳生菌數的檢測
生菌數的測定方法是將生乳乳樣經系列稀釋後，取1 ml置於3 M薄膜試劑（3M
petrifilm, 3M Health Care, St. Paul, U.S.A）上，以壓板壓平後，於37℃下培養48
hr後計數。
三. 生乳生物冷光反應RLU值檢測
生乳生物冷光反應之RLU值測定操作步驟如下：以LUMAC公司生產之Celsis Lumac
â milk bacteria kit為試驗藥劑，乳樣及藥劑均以微量吸管（Pipetman, Gilson,
France）吸取。取待測生乳乳樣50m l置於lumacuvette中，加入80m l NRS（可釋出食品
中非微生物的ATP），再加入20m l Somase（水解ATP的酵素，可分解添加NRS後所釋出食
物中之ATP）後於室溫下震盪5 min，然後加入100m l L-NRB（用以釋出活的微生物細胞內
之ATP），30 sec後再加入Lumit-PM（含有螢光素繍，可與ATP作用產生螢光），最後以
ATP生物冷光儀（Celsis lumac biocounter M2500, Landgraaf, Netherland）讀取RLU值
（Anonymous, 1997）。
四. 生乳生菌數與其ATP冷光反應RLU值之標準曲線製作
首先製作生乳生菌數的檢量線，分批檢測生乳乳樣，這些樣品的生菌數最好能均
勻的分布在104～107之CFU/ml間，每個乳樣以3M薄膜試劑檢測生乳之生菌數，同時並應用
ATP生物冷光反應儀測定生乳RLU值，將所得生菌數與RLU值結果（n＝62）分別取對數值後
，以SAS軟體（Snedecor and Cochran, 1980）迴歸運算，求出迴歸方程式。此製定後之
標準曲線，即可將測定所得之生乳RLU值代入方程式，求出其所對應的預測生菌數。
五. 美藍還原試驗（methylene blue reduction test）
依中國國家標準乳品檢驗法檢驗（CNS N6068）。取1 ml美藍試液置於無菌的試
管中，加入10 ml的生乳，倒轉3次後，置於37℃水浴保溫培養，分別於30 min、2、5.5及
8 hr時，觀查藍色是否褪去，若褪去則取出試管並記錄時間，未褪去則倒轉一次後，再放
入水浴中，直至8 hr結束為止。
結果與討論
經檢驗62個生乳樣品生菌數與其ATP冷光反應RLU值所得之結果，分別取對數值後
，由SAS統計軟體分析求出迴歸方程式為y＝1.29x＋2.06（y為生菌數的對數值，x為RLU值
的對數值），再計算出相關係數r2值為0.87（P＜0.05），顯示兩者的相關性良好（圖1）
。許多學者的研究結果均顯示，ATP生物冷光反應的RLU值與生菌數，兩者間存在很好的線
性關係（Cutter et al., 1996；山本，1997；竹內，1997）。
圖1. 生乳生菌數與其ATP冷光反應檢測之相關性。
Fig. 1. The relationship between standard plate counts and ATP
bioluminescence reaction of raw milk.
當建立生菌數與其ATP冷光反應RLU值的對數值迴歸方程式後，亦同時加入傳統乳
品品質的檢驗方法，以美藍還原試驗，評估ATP生物冷光反應法是否可取代美藍還原試驗
。由實驗結果得之，生乳生菌數與美藍還原試驗存在相關性，當生乳美藍還原試驗的褪色
時間在大於8、5.5及2 hr區間，則生乳生菌數分別是低於105、106及107 CFU/ml，當美藍
還原試驗時間低於30 min時，生菌數則已超過108 CFU/ml。根據張的著作（1989）顯示，
美藍還原試驗中，當褪色時間為5.5 hr、2 hr、20 min以上時，其生菌數為分別5.0×105
、4.0×106、2×107 CFU/ml以下，與本研究ATP冷光反應實測值所對應出的生菌數很接近
（表1）。
表1顯示RLU值所預估的生菌數與實測生菌數的結果相接近，沒有顯著差異（P＞
0.05）。由迴歸方程式得知生菌數為105、106、107、108 CFU/ml時，其RLU值分別為1.9
×102、1.1×103、6.8×103、4.0×104 RLU，由此結果亦可將生菌數分成不同的群組。
本研究結果發現，可適用在86年11月農委會生乳計價會議所得之草案資料中的生菌數部分
，此生乳品質計價標準分為生菌數與體細胞數兩者同時分級計算，在生菌數部分分成10萬
以下、10～30、30～50、50～70、70～100、100～120萬CFU/ml等六組，另生菌數大於120
萬CFU/ml的生乳則裁定為拒收。由ATP生物冷光反應法檢測的結果和美藍還原試驗比較，
ATP生物冷光反應可在6分鐘內即可得知RLU值，再經由本研究所建立的生菌數與其ATP含量
的標準曲線，可快速推估生乳的生菌數。美藍還原試驗結果僅能大略將乳品的生菌數區分
出生菌數為105、106、107 CFU/ml等不同等級，且整個試驗期間需時8 hr。因此ATP生物
冷光反應技術比美藍還原試驗能更快速且精確地測得生乳微生物品質。
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