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co immunoprecipitation中文 在 Re: [問題] 請問pull down assay跟CO-IP的差別... - 看板Biotech 的推薦與評價
※ 引述《linzhengzhan (研究所:碩士班vs博士班)》之銘言:
: ※ 引述《sezko (一般大學比較適合我)》之銘言:
: : 請問一下這兩種方式的差別是什麼呢..??
: : 是不是因為pull down assay並不是使用抗體所以才另外取一個名字的阿..??
: : 兩者不都是觀察protein的interaction狀況嗎..??
: : 還有pull down的專一性是否沒有CO-IP高呢..??
: : 謝謝解答阿....拜託拜託.......
: co-ip是用antibody與antigen的特異性來操作protein interaction的實驗,事實上
: antibody的性質好壞與否,會決定實驗的品質與,甚至成敗……
: -A protein Ab.-A protein-B protein
: ^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^
: 成敗的關鍵↑ ↑有興趣的protein
:
: 而pull down assay是將已知的protein做成fusion protein (ex.GST),利用enzyme-
: substract的specificity來將已知的protein抓著固定,之後再與其他protein
: interaction,所以嚴格說不會有上述的問題……
: ex.
: Glutathione-GST-A protein-B protein
: ^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^^
: ↑Matrix ↑fusion protein ↑有興趣的protein
: 所以你要說這兩個方法那一個比較好,見人見智;因為這兩個方法都是Paper中,公認的
: 方法……
Co-IP 與 Pull down assay 的確都是用來證實 protein-protein interaction 的方法
不過它們各有各的優缺點及限制
Co-IP: 實驗步驟較簡單,但是較浪廢 antibody,其限制在於只能證實 indirect
interaction,且容易有 contaminated signals, wash buffer 的離子濃度以及
wash 的次數都要控制的當才不會導致誤判.
Pull down assay: 通常是用兩個 pruified proteins 來進行,其中一個 protein fused
到 tag (如上敘的 GST)當成 bait, 藉由 pull down fusion protein 而將另一
個 protein (當 prey) 給抓下來,因為是由兩個 purified proteins直接進行,
所以可證實此兩 proteins 為 direct interaction 而不藉由其他的 proteins.
不過 purified proteins 大多是在 E.Coli中 overexpression,很可能因為沒有
正常的 protein folding 或者 modification 而導至誤判.不過現在已經有一些
在真核細胞中 overexpression 的 system, 可以克服 folding 及 modification
的問題了.
進行此兩實驗時都必需有適當的 negative control才能下結論,否則可能因 wash buffer
濃度 or wash 次數不同而得到不同的結果,至於哪一個的 specific 較好,我想是取決於
兩 proteins interaction 的強弱, 用 antibody 做 IP 不是也常常抓到一堆雜 bands
嗎.
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