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ligation比例 在 [求救] ligation都接不起來- 看板Biotech 的推薦與評價


作者ennnnno (小玲)
看板Biotech
標題[求救] ligation都接不起來
時間Mon Dec 27 11:12:40 2010


大家好,目前在進行ligation碰到了問題

請大家幫幫忙


我目前要接的insert是2k,而vector是8k左右

insert是從pGEMT上面切下來的

經過gel elute之後濃度約45ng,260/280為1.95

而vector濃度約55ng,260/280為1.85

試了幾個condition,

V:I= 2:4,1:4,1:6,1:8,2:5,2:7,1:5,1:7,3:3

在16度裡overnight(至少有22小時,時間太長了嗎?)

然後跟JM109做transform,放冰上30min後塗盤

可是都沒長><


然後跟學姊討論,學姊說不然做一個加LB recover的動作

所以又再試了一次

v:i=6:4,1:9,1:7

這次改用2x rapid buffer,之前都是用10x

然後這批是在4度c裡ligation兩天

做transform之前加了500ml LB(NO AMP) 37度裡1小時

之後用800rpm離一分鐘,菌有離下來

然後去掉上面400ml的LB,剩下的塗盤

只有6:4那個有長,但只有一顆><


想請問大家說,到底出了什麼問題

因為insert也是從pGEMT上切下來的

會有切不完全的問題嗎?

vector是之前實驗室接另一個基因的

再把insert基因切下來,把vector elute下來 (切位相同)

所以也是確定有切動,size一樣

因此想問問有經驗的老手,我是否還要修改哪個地方呢?謝謝~~~~





--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.55.238
→ ennnnno:不好意思再補充一點,第二次做ligation,v:i=1:7,1:9的部份, 12/27 11:15
→ ennnnno:insert濃度是25ng(之前用完了重新elute),另外有做positive 12/27 11:16
→ ennnnno:control,所以確定不是plate的問題,謝謝~ 12/27 11:17
→ qumai:濃縮DNA吧 其他看起來都沒什麼問題 competent cell是自製嗎 12/27 11:53
推 FENOR:V:I用1:3，然後把除了ligase之外的東西都加好，接著用一杯 12/27 12:07
→ FENOR:70度的水，把混有這些東西的eppendorf放進去(上浮船) 12/27 12:08
→ FENOR:溫度降到30-40度時再拿出來離心加入ligase，ligate一小時就 12/27 12:08
→ FENOR:可以拿去transform了。 12/27 12:08

F大的方法真的很有新意耶~我來試看看,接不起來真的好煩啊><
另外想請問一下F大,降到30-40度是讓溫度慢慢降?
還是說70度裡要放多久???謝謝~
加入ligase後是在幾度下做ligation呢?謝謝

推 liuse:樓上這什麼怪方法 70度的水.... 12/27 12:19
推 SugarSa:有些人說ligation 前提高一下溫度,效率會比較好 12/27 12:22
→ SugarSa:應該是為了讓捲在一起的DNA先暫時分開 12/27 12:22
→ ennnnno:competent cell是買的~ 12/27 14:45
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:47)
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:48)
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:50)
推 FENOR:慢慢降 12/27 19:04
→ missoul:F大的方法: 把DNA展開 並逐漸降溫讓互補股稍稍靠近 12/27 23:11
→ missoul:但是我建議不要把buffer(ATP)也加溫了 怕有破壞 12/27 23:11
推 mattmatt:請問V:I是體積比 重量比 還是莫耳數比? 12/27 23:19
→ mattmatt:另外請問ligation total體積? 使用的切位是甚麼酵素? 12/27 23:19

不是莫耳數比耶,是指的是體積比
使用的RE是EcoRI和SpeI
vector是psin-EF2-vector,約8.5k

推 leoblack:當然是莫爾數比 12/28 00:15
推 Invec:介紹一個promega的計算軟體https://www.promega.com/biomath/ 12/28 01:43
→ Invec:進去後找到 Ligations: Molar Ratio of Insert to Vector 12/28 01:43
→ Invec:然後輸入I, V的大小以及V的ng數，系統會幫你計算I的ng數 12/28 01:44
→ Invec:最後再按照它建議的ng數調整體積即可 12/28 01:45
→ Ianthegood:transformation有沒有出錯的地方阿? 12/28 07:02

transformation會出錯的地方是!?
我做transformation就是直接加入JM109,然後放冰上30分鐘後塗盤
之後做LB recover的動作就沒放冰上了,直接放37度一小時
難道是這部份錯!?
但之前放冰上30分鐘也是沒長..=____=

推 micocat:ligase確定是好的嗎 ligase buffer不要在室溫回溫哦 12/28 15:43
→ micocat:還有依你的描述transform好像沒heat shock ? 12/28 15:45
→ micocat:是說commercial的不hest shock應該也可以啦 12/28 15:45

嗯我沒做heat shock的動作耶~
不要在室溫回溫?我都是拿在手上然後等他回溫耶
ligase這部份我不確定耶,但之前做pGEMT ligation時他有長
那時候篩了約50顆有
不會之後又突然壞了吧....


昨天有試了f大的方法
但還是沒長......(哭)
到底是什麼地方出問題??嗚嗚~~~~~



※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/28 16:51)
推 mattmatt:用體積比計算是錯誤的 要用莫耳數比 12/28 22:58
→ mattmatt:按照你vector和insert的大小 V:I要1:3的話 12/28 22:58
→ mattmatt:vector建議150~200ng insert大概100~150ng或更多 12/28 22:59
→ mattmatt:將以"純水"回溶的純化過的vector與insert加入tube後 12/28 23:00
→ mattmatt:65度五分鐘 spin down然後馬上放冰上 再加入buffer ATP 12/28 23:01
→ mattmatt:與ligase, total體積不超過20ul(建議10ul) 12/28 23:02
→ mattmatt:依你的切位 放在12度C以下會比較好 over night ligation 12/28 23:03
→ mattmatt:ligation完後加入competent cell 混勻後冰上30~45min 12/28 23:05
→ mattmatt:雖然是commercial的 還是建議做一下heat shock... 12/28 23:06
→ mattmatt:42度90秒 (commercial應該30秒即可) 然後冰上5min 12/28 23:07
→ mattmatt:然後加入1ml LB,37度搖晃(250rpm)培養1hr.. 12/28 23:08
→ mattmatt:養完後用8000rpm離心5min 去除上層medium 留100ul LB 12/28 23:09
→ mattmatt:懸浮後塗盤 (commercial的 LB可以只養30min) 12/28 23:10

好,謝謝你~我會再試看看的!!!
很謝謝大家的回應耶
你們人真好!!我要再努力看看~~~~~

※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 10:27)
推 icome:何不多花1分鐘做heat shock? 12/29 12:04
→ blence:pGEMT+I是5k,你的I+V是10k,這樣的大小差異比可行性完全不對 12/29 14:16
→ blence:沒用heat shock,而且10k還用JM109,要成功應該難上加難 12/29 14:18

請問大小差異比是什麼意思呢?
因為insert不也是要從pGEMT上切下來嗎??
insert:vector=1:4這種比例不好接嗎??

JM109比較難transformation嗎??
謝謝~~~~


※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 15:46)
推 yaliu:應該說10k本身就不好轉進去，再不heat shock機率更低吧 12/29 20:40
→ yaliu:然後你的vector應該也是自己製備的吧，或許比起商業的效率差 12/29 20:41
→ yaliu:妳可以確認看看到底是沒接成功抑或是沒轉進去 12/29 20:43
→ yaliu:個人認為轉型失敗的可能性較大啦 12/29 20:43
推 FENOR:你為什麼沒做heat shock???? 12/30 00:18
→ FENOR:我用的ligation buffer其實在室溫下回溫也沒差 12/30 00:19
→ FENOR:而且heat shock完之後要用LB medium讓菌recover 12/30 00:20
→ FENOR:時間也不用太長，大概十分鐘到十五分就可。 12/30 00:20
→ FENOR:heat shock 30-90秒都可以 12/30 00:21
推 iceking:原po原本用的是commercial的勝任細胞,照protocol做就是不 12/30 10:05
→ iceking:需要heat shock,也不需要recovery~ 這也不能怪原po 12/30 10:07
推 FENOR:喔喔，因為我也沒用過這種的細胞 12/30 11:53
→ dragonjaff:有做control組嗎? 試試看把vector切一刀再接回去吧 12/30 16:35
→ dragonjaff:會長的話至少可以確定不是transform的問題 12/30 16:36






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相較其他器官，NK 細胞在肝臟的淋巴球中佔了相當大的比例，表示NK 細胞在肝臟的免疫反應 ... 藉由總膽管結紮(common bile duct ligation, BDL)引發大鼠慢性肝傷害，假 ...

#60. GoldenBraid酶切连接反应体系的优化 - 生物技术通报

Optimization of GoldenBraid Digestion-ligation Reaction System ... 有效克隆比例接近99%,是优化前（BsmBI 8%、BsaI 23%）的4倍以上,此时酶切连接效率接近100%。

#61. 大腸直腸外科| 肛門膿瘍及瘻管 - 中國醫藥大學新竹附設醫院

發生率男女比例約3:1，年齡大多介於30-50歲之間 ... 另有一新型手術方式稱為LIFT (Ligation of Inter-sphincteric Fistulatous Tract)，可針對複雜或長形的瘻管，以 ...

#62. 基于分子信标实时监测大肠杆菌DNA连接酶催化的DNA连接过程

Real-time Visualization of Ligation Reaction Catalyzed by E.coli DNA Ligase Based on Molecular Beacon. LIU Ling-Feng, TANG Zhi-Wen, WANG Ke-Min, ...

#63. 安全技术说明书

SD1042 - 5X RNA (ssDNA) Ligation Buffer. 修订日期2021-02-06. 组分. CAS 号. 类别. 条例编号. 含量比例%. Hexaamminecobalt(III) chloride. 10534-89-1.

#64. TaKaRa DNA Ligation Kit LONG - タカラバイオ

15 時. 間の反応で出現したコロニー数を 100％として、各反応時間でのコロニー数の比率を計算した。 粘着末端では 16℃、3 時間でライゲーションがほぼ完了し、15 時間の ...

#65. CTG 三核苷重複的遺傳分析與細胞模式研究 - 罕見疾病基金會

取1 μl 的PCR 產物，以1：8 比例用水稀釋，再以聚丙醯胺膠體 ... 六、接合反應(ligation) ... DMPK 之CTG 擴增至150 個重複，染到RNA foci 之細胞比例也只有.

#66. 國立中山大學093學年度第1學期分子生物學實驗課程大綱

尚未建立傳染性肺炎(武漢肺炎)課程評分方式﹝評分標準及比例﹞ ... DNA ligation and bacterial transformation 3. Selection of cloned gene 4. Southern blotting

#67. [實際案例分享] 以HiFi 定序技術更精確地完成微菌叢分析與總體 ...

... 代表未能被分類的細菌物種比例，顏色愈深代表該序列的分類效果愈差。 ... community by combined long-read assembly and proximity ligation.

#68. DNA连接反应中不可忽略的技巧 - BioEngX

今天这篇文章，给大家介绍一些可以提高连接效率（ligation efficiency）， ... 不但要有对照（controls），而且还要尝试不同的vector: insert 比例。

#69. 藥品給付規定通則 - 臺北榮民總醫院

限用經標準檢測方法MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe ... 面積計算：成人依照rule of nines(詳備註1)，由部位乘予大約比例之總和，兒童.

#70. LigaFast(TM) Rapid DNA Ligation System @ janym01 - 痞客邦

我記得以前在研究所的時候做ligation 常常因為比例不好而挑clone挑了半天. 一個月一個clone都還挑不到...(可能是因為個人因素.

#71. 國立成功大學機構典藏

... 依賴(dose-dependent)的現象；即當劑量增加時其血壓也呈比例的增加。 ... 最後，再透過原位鄰位連接分析(in situ proximity ligation assay)， ...

#72. Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module 新型DNA连接模块翌 ...

生物在线为您提供众多企业Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module 新型DNA连接 ... 根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔 ...

#73. 2020 年實驗動物科學（技術篇）

增加自體反應T 細胞（auto-reactive T cells）的比例或減少抑制發炎反應的 ... 4.2.2.1 膽管結紮（ligation of the common bile duct）.

#74. 東沙島微生物菌相分析及研究 - 海洋國家公園管理處

DNA 序列中G+C 含量高的革蘭氏陽性菌所佔的比例較高( Sekiguchi et al., ... 將溶解後的competent cell 取25μl 加入overnight 反應完成的ligation 溶液，輕輕的.

#75. 2012 IGEM 國際生物合成競賽實驗手冊

以25g LB+15g agar/1L 二次水的比例調配所需的量。 ... **Ligation 的buffer (T4 DNA ligase buffer 和1mM ATP)不可用手握回溶! 要在冰上溶解!!

#76. DNAフラグメントとプラスミドのライゲーション ... - M-hub

比率を変えるときはフラグメント比の数字の3を別の数値に変更します。 ライゲーション実験には慣れと経験が必要ですが、しっかりとコントロールをとり、 ...

#77. Re: [求救] ligation怎麼接都接不出來- biotech

Re: [求救] ligation怎麼接都接不出來 ... 為了算比例還特地會去測濃度在算molar ratio比例1:3下去做: 用過很多種ligation kit，沒有一次transform是有長半顆的.

#78. 內科部胃腸肝膽科工作手冊 - 台中榮總

恢復內科治療病人的比例在研究延續到5 年時為11%-32%，10 年時 ... 內視鏡檢查，或初次內視鏡檢查無法確認出血病灶地無法執行band ligation 或.

#79. [求救] ligation失敗

[求救]ligation失敗@biotech，共有34則留言，18人參與討論，11推0噓23→ ... 還是應該提高I:V比例(1:5 or 1:7)? (2)還是我ligation的的時間/溫度不對?

#80. 肠系膜淋巴管结扎减轻二次打击所致大鼠肝损伤

Mesenteric lymph duct ligation against hepatic injury subjected to two-hit in rats. Geng ZHANG, Jun-Xu REN, Zi-gang ZHAO, Yu-ping ZHANG, Chun-Yu NIU, ...

#81. Taipei Medical University Institutional Repository:Item ... - TMU

... 油高膽固醇飲食引致；敗血症則以盲腸結紮及穿刺術（cecal ligation and puncture，CLP）引致，動物實驗中魚油飲食之n-3和n-6比例均調整成1 : 2。

#82. 国自然基金- MedSci

Cerulein组3d时TGF-β表达低于Ligation组。2. ... 显示CP造模后3d、7d、14d的原代培养骨髓细胞的克隆形成率均显著高于对照组；获取的MSCs细胞比例显著高于对照组的。

#83. Ⅰ类切口围手术期抗菌药使用分析 - 药物流行病学杂志

结果：围手术期抗菌药预防应用率为93.68%，给药时机合理的比例为82.53%，给药品种 ... and internal fixation,and high ligation of internal spermatic cord vein.

#84. 台灣市售抗固殺草基改大豆之篩選及其基因特性分析

施藥後3-4 日，多數大豆植株呈現傷害徵狀，並於1 週內枯死，12 組測定樣品中. 均有抗藥性之植株，其所佔比率介於0-13%之間，初步推測為抗固殺草之轉基因大. 豆。進一步抽取 ...

#85. 文化大學機構典藏CCUR

... 利用給予盲腸結紮及穿刺手術(cecal-ligation-and-puncture ,CLP)引發敗血症之老鼠GLN的補充後，觀察血中EPC 的比例及器官中内皮細胞受損之評估。

#86. 【細胞中的"記憶"如何遺傳到下一代的呢？】 生物體性狀以基因 ...

... 與祖母在年輕時的飲食情形分別與孫子和孫女死於糖尿病相關併發症的比例相關；而另 ... 研究者利用proximity ligation assay（PLA）觀察胚胎發育過程中哪些表觀遺傳 ...

#87. 理學院應用科技學程 - 國立交通大學機構典藏

種中出現的比例比亞洲人種來的高[47]，這樣的基因突變並沒有造成 ... 1 μl ligation buffer A、1 μl ligation buffer B 以及1 μl 的T4 DNA ligase.

#88. Colning | IMB205 - Hanna Yuan's Lab at IMB Academia Sinica

(4) DNA黏合反應(DNA ligation). 將切割過的DNA片段(insert) 與經過同樣限制酶處理的載體(Vector) 以不同莫耳數比例(1:1, 3:1,或6:1) 進行黏合反應,37℃ 1hr 或16℃ ...

#89. tubal ligation中文- 英漢詞典 - 漢語網

英漢詞典提供【tubal ligation】的詳盡中文翻譯、用法、例句等. ... 結扎對象總人數的0.9%，由於盆腔粘連導致手術失敗者比例占42.22%，導致手術效果不理想者22.22%。

#90. 快速DNA连接试剂盒（Quick DNA Ligation Kit）（ZC224）

*3：T4 DNA Ligase应最后加入反应体系。 如果使用5ul体系连接，各成分按照比例减半使用，连接效率不变。 加完试剂后，用移 ...

#91. 内镜下套扎治疗晚期血吸虫病食道静脉曲张破裂出血68例

Endoscopic ligation in treatment of advanced schistosomiasis patients with esophageal variceal bleeding：a report of 68 cases. LIU Pei-xiang|KONG Guo-qing.

#92. Ligation high 科研用 - 东洋纺

另外，本说明书介绍了使用Ligation high 时的标准结果。 ... 要控制反应液量时，可减少DNA 液体的使用量，和相当于其半量的Ligation ... 表2 白色菌落的比例（%）.

#93. 常に頭に入れておきたいDNAクローニングに関する7つの ...

確実に効率の良いクローニングを行なうためにはインサートに対するベクターのモル濃度比を最適化することが重要です。クローニングを成功させるための比率 ...

#94. 純.淨客戶一致好評的

完全移除dNTP& primers, 提升後續ligation 實驗效能 buffer添加顏色pH指示劑,藉由觀察顏色變化來確保 ... 使用量可依照樣品量來等比例調整. 實驗驗證1: PCR 產物不流失.

#95. ligation溫度時間 - 軟體兄弟

軟體兄弟 · vector insert比例; 文章資訊. 大家好,目前在進行ligation碰到了問題請大家幫幫忙我目前要接的insert是2k,而vector是8k ... 在16度裡overnight(至少有22 ...