國際血栓形成和止血學會更新了AZ/嬌生疫苗引起的血栓併血小板低下的診斷和治療指引。給大家參考。
#國際血栓形成和止血學會(ISTH)
Vaccine Induced Immune Thrombotic Thrombocytopenia（VITT）診斷和治療指引（2021.4.20更新）
Step 1.#誰有風險得到VITT？
a) 是否在注射AZ或是嬌生新冠疫苗後4~28天發生症狀？
b) 是否有血栓的症狀或徵候？
可能的例子包括新發生的：
○ 嚴重而持續的頭痛，可能加上視力改變，癲癇發作（肢體有不自主的動作）
○ 嚴重而持續的肚子痛
○ 小腿腫脹或是痛
○ 胸痛，可能加上呼吸困難
如果問題ab都沒有，那就不是VITT。請照臨床常規處理。
如果ab皆有，請往Step 2。
Step 2.#對於有風險的病人如何做VITT的篩檢？
a) 根據症狀做適當的影像檢查來確認是否有血栓。（比方說頭痛者做頭部電腦斷層靜脈血管攝影，肚子痛做腹部電腦斷層靜脈血管攝影）
b) 安排緊急的全血細胞計數（CBC）。
如果影像檢查上沒有血栓：那就不是VITT。
如果血小板正常大於15萬：VITT不是很可能。
如果有血栓的證據，且血小板小於15萬：請往Step 3。
Step 3.#初始評估
做標準的血液凝固相關檢查 (D-dimer, PT, aPTT and Clauss fibrinogen)
檢查有無抗血小板第四因子的抗體（anti-PF4，不是所有的試劑都可以偵測此抗體，HITT ELISA最可靠）
如果可靠的PF4抗體檢查陰性，那可排除VITT。就當一般血栓治療。
如果PF4抗體檢查陽性，特別是OD值很高，那就很可能是VITT。可以做確診的功能性試劑檢查，並當VITT處理。
如果沒有PF4抗體檢查可做，可檢查D-dimer。如果顯著上升的D-dimer很可能是VITT，比方說四倍以上上升。可當VITT處理。
Step 4.#治療
1.測PF4抗體可能須要時間。如果看起來可能，不要等待結果出來才給治療。
2.立刻給予免疫球蛋白兩天的療程（IVIG 0.5 to 1 g/kg daily for 2 days）
3.在血小板小於5萬者可考慮使用類固醇（prednisone 1 to 2 mg/kg）
4.避免輸注血小板，除非病人需要緊急手術。避免使用肝素相關藥物（heparin, LMWH），避免warfarin。
5.在血小板大於5萬且沒有嚴重流血者，建議給予非肝素的抗凝血藥物：fondaparinux, argatroban, or a direct oral anticoagulant (e.g., apixaban, rivaroxaban）
6.照會血液科醫師。
7.考慮血漿交換（plasma exchange）或是補充Fibrinogen纖維蛋白原到其濃度大於1.0 g/L。特別在如果血小板在給予IVIG還有類固醇後還是小於三萬，或是纖維蛋白原到其濃度小於1.0 g/L。
提醒：
1.VITT處置是個進展中的議題。請注意參考最新版本的指引。
2.每個國家或地區應該依據當地的醫療型態還有檢查有無修正成自己的治療指引。
3.列出可以做PF4抗體檢查的實驗室，或是可以聯絡的血液科專家可能有幫助。
elisa od值 在 [求救] 關於自製ELISA standard濃度過低的問題- 看板Biotech 的推薦與評價
各位好，
目前接了一個實驗是設計一個indirect competition ELISA
手上有的東西:
1. human X full-length recombinant protein (欲測蛋白, 非所使用一抗的immunogen)
2. anti-human X mouse monoclonal antibody
(Primary Ab, immunogen為另一來源的full-length X protein, unknown epitope)
3. anti-mouse IgG1 rabbit antibody (Secondary Ab)
4. Human serum sample
5. Human plasma sample
==
||
ELISA策略是：||-X <-1Ab-2Ab*HRP
|| AG->
先將antigen X coating在ELISA用96-well，blocking，
加入待測物AG 與序列稀釋的X (as standards)，
再加入Primary Ab, Secondary Ab, TMB substrate, stop,
Count OD at 450nm by ELISA reader.
如若加入的sample會搶走Primary Ab,
則結合在solid phase的X 就會得到比較少的Primary Ab與後續反應的呈色。
([AG]↑，則 OD↓)
==
實驗設計之初，
我titrate primary Ab 與 coating Ag,
得到這個結果 https://0rz.tw/h1S3k (Excel表單，第一個工作表)，
由此表得知coating Ag在250ng/ml時 OD值 Max-min的range最大，
而Primary Ab則在4000x dilution時 OD值 Max-min的range最大，
所以我初步設定coating Ag = 250ng/ml, primary Ab = 4000x dilution.
接著我使用此condition測不同稀釋倍數的human serum sample，
雖然測試點位不多，但也能明顯看到OD隨著濃度上升而下降
https://0rz.tw/h1S3k (第二個工作表)
未稀釋的plasma組 (OD=0.29) 與未加sample的blank組 (OD=2.24)
OD值差距可以拉到將近2.0;
然而我如果使用序列稀釋的 X recombinant protein當作standards
從濃度 3333ng/ml 兩倍序列稀釋，
https://0rz.tw/h1S3k (第三個工作表)
即使加入最高濃度standard, OD值仍然有1.62之高，降不太下來，
與沒有加的blank組 (OD=2.24) 比較起來只相差0.6不到...
而低濃度standard的組別，也幾乎就在2.1上下徘徊，
與blank組也相差無幾，等於可測得濃度的sample range相當小，
運用在不同來源的sample時會窒礙難行。
我下一步可能會把standard的最高濃度再上調，
試試看是否能夠畫出range比較大的curve,
只是相對於其他commercial ELISA kit的standard大多落在 1000pg/ml~100ng/ml,
我所設定的standard濃度已經算是相當高，
再濃下去 我的recombinant protein用量與開銷就得突破天際了...
===
基於以上遇到的狀況，
有幾個問題想請教大家：
1. 除了繼續加大standard用量以外，我應該如何調整實驗condition,
才能把standard濃度拉低 curve仍能維持呢？
2. 這樣的問題是由於standard對coating Ag的競爭性太弱所導致嗎？
可是兩者我都是使用同一種recombinant protein去作，
對打濃度也達到3333ng/ml vs 250ng/ml了，
怎麼3333ng/ml 搶primary Ab 還是搶不過 250ng/ml的呢？
3. 另外有一種有別於competition ELISA的 inhibition ELISA,
是把protein先與primary antibody incubate之後，
再加入well與coating Ag反應呈色，
但我不大了解這樣做的原因，所測的目標是coated protein嗎？
以上，謝謝看完繁雜的文章，
有任何看不懂的地方也請告知，我會再作更仔細的說明，
感激。
台灣隊十二強加油！
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