此次疫情傳播如此快速,敏盛醫院副院長江坤俊解釋跟病毒量有關。
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Real -time PCR可算出病毒「陽性」定量的Ct (Cycle Threshold) 值,意即螢光 ... 當新冠肺炎PCR指定檢驗機構檢測出陽性結果,Ct值很高,也要向CDC昆陽 ... ... <看更多>
real time pcr ct值 在 Re: [求救] real-time PCR Ct值疑問 - PTT Web 的推薦與評價
Re:[求救]real-timePCRCt值疑問@biotech,共有1則留言,1人參與討論,1推0噓0→, ※ 引述《naruto200420 (賤仔翔)》之銘言:: 每次做real-time PCR, ... ... <看更多>
real time pcr ct值 在 Re: [求救] real-time PCR Ct值疑問- 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
※ 引述《naruto200420 (賤仔翔)》之銘言:
: 每次做real-time PCR,做四重複,結果Ct會產生兩兩分群的現象,也就是數值兩個兩個
:
: 相近,造成取值非常的困擾,但是melting curve卻是很有專一性的,之前懷疑是pipet error的
:
: 現象,所以嘗試放大體積來加cDNA,可是結果沒有甚麼差異!?請問有板上的大大有有類
:
: 似的經驗嗎?
:
: 另外加試劑的順序,氣泡存在與否,是不是會造成影響呢?
:
: 我的順序為先加水、sybrgreen、Primer混合成一管mix,分別加入8聯排,再加入
:
: cDNA,希望大家可以幫幫我啊QQ
:
: --
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: ◆ From: 140.112.4.209
: → roy047:氣泡在一開始加熱時就會破光了吧? 08/07 11:33
: → roy047:順序的話通常是體積大(水)先加, 原po寫的應該沒什麼問題 08/07 11:35
: → untilnow:換一排做 可能某幾個孔加熱有問題 08/07 11:43
: → naruto200420:那pipet要到第二段嗎,感覺sybrgreen mix 都會殘留 08/07 12:03
: → huuban:我去的實驗室是不用8連排的.. 08/07 14:13
: → ai760721:我都不用第二段 我覺得第二段出來有時候會黏在tip上 08/07 14:14
: → naruto200420:不推第二段,ct會跟之前的data有所差異吧,是mix還是cD 08/07 14:23
: → naruto200420:NA不推二段 08/07 14:23
: 推 mesenchymal:我的話會水跟cDNA mix在同一管,primer跟SybrGreen 08/07 23:29
: → mesenchymal:一管,不過我的問題是你這現象實驗室其他人也有嗎? 08/07 23:32
: → jsi:數值兩群差距有多大? 如果方法對,做三重覆即可,偶數組重覆 08/07 23:32
: → jsi:有點自找麻煩哪... 08/07 23:33
: → mesenchymal:如果其他人也有, 我懷疑是機器或tube的問題 08/07 23:34
: → naruto200420:如果cDNA降解會這樣嗎? 08/08 00:46
: → naruto200420:其他人也有Q_Q 08/08 00:46
: → naruto200420:兩組ct大約差0.7-1.5 08/08 11:31
ct差1其實就有點多了, 這表示RNA 量差了2倍左右,
如果你RNA是要看2-3倍的fold change那error會超大. 但如果是那種100 fold之類的
差異就還好
melting curve是看你的primer有沒有亂anneal
melting curve正常還是不能排除你在pipette的variation
聽起來最有可能的還是pipette的誤差
我自己的經驗是我們lab習慣是18ul的master mix加2ul的sample
master mix在加之前要vortex足夠,
之後每個well 加18ul的動作, 不要換tip, 推pipette盡可能等速而且不要太快
(太快會有部份殘留在tip), 我自己是會推第二段, 重點是要看到tip全空
同一個master mix的所有well用同一個tip, 然後tip盡一切可能每次都排空
加sample時也是要先vortex足夠然後慢慢加. 一開始學RT-PCR時會怕taq開始nonspecific
所以想盡快, 但後來發現這是杞人憂天, 只要你的plate在冰上,
幾乎不會有問題. 所以不如穩穩的確認每次master mix跟sample都排空.
RT-PCR因為太sensitive所以一點點小差異一被放大就差很多
所以盡可能在加每個動作時都龜毛到極點,
有些定性的實驗像PCR, 其實你buffer啊水啊差個0.1ul其實根本沒差,
但RT-PCR就是要斤斤計較, 我甚至後來setup plate時都不聽音樂,
而且要在人最清醒時作, 狀況不好時容易出錯
因為我們lab看的東西常常是3-5個fold的差異而已,
Ct差超過0.5就很可能不能相信了.
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