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[求救]Transformation失敗@biotech,共有93則留言,22人參與討論,26推0噓67→, ... 45 F → tynse71864: 這也是菌沒長太多的原因 09/10 15:17. ... <看更多>
transformation失敗原因 在 [求救] Transformation失敗- 看板Biotech - 批踢踢實業坊 的推薦與評價
小弟是才疏學淺的專題生
最近要送一個Vector4.5k Insert3.6k的質體
酵素是NEB的KpnI-HF以及XhoI
根據NEB的Double Digests推薦的protocol
酵素切1ug的DNA 37度15分鐘 跑膠確定有切完
ligation的部分比例是3:1 4度overnight
送進Stbl3勝任細胞
ligation product 5ul跟10ul都有試過
加入後按照stbl3 protocol 冰上30min
heat-shock 42度45sec 再冰上三分鐘
然後SOC 37度 recover 1hr
抗生素是用Kanamycin 塗盤卻只有一兩顆或是完全沒長
有一次check挑到一個clone有band
但是用Kna-LB養小量(20ul)一小時之後菌就消失了QQ
同儕也使用同一批勝任細胞送質體 長得很正常
請問各位大大ligation的部分還能怎麼改進嗎
如果有哪裡不對還請用力鞭
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 101.10.95.187 (臺灣)
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1631032704.A.187.html
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 00:49:00
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/08/2021 01:23:14
※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:36:45
※ 編輯: AndrewsLiu (60.251.229.159 臺灣), 09/08/2021 13:37:35
另外我Insert都是用55度ddH2O回溶的
※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.157.21 臺灣), 09/08/2021 15:02:11
※ 編輯: AndrewsLiu (59.124.156.99 臺灣), 09/08/2021 22:21:42
InsertPCR後、Vector酵素切後都有切膠取 Insert的酵素切之後是直接clean up回收
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:34:31
※ 編輯: AndrewsLiu (101.10.95.187 臺灣), 09/09/2021 00:37:18
primer校正 所以insert應該是不會有太大問題的QQ
... <看更多>
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